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Lee, S. William Li, … Ziv M. WilliamsScientific Reports volume 12, Numero articolo: 22535 (2022 ) Cita questo articoloIl Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) è un disturbo pervasivo del neurosviluppo che emerge nei primi anni di vita caratterizzato da menomazioni nell'interazione sociale, scarsa comunicazione verbale e non verbale e modelli di comportamento ripetitivi.Tra i fattori di rischio genetici più noti per l'ASD, ci sono mutazioni che causano la perdita della Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (FMRP) che porta alla sindrome dell'X fragile (FXS), una forma comune di disabilità intellettiva ereditaria e la principale causa monogenica di ASD .Essendo un regolatore fondamentale dell'attività motoria, della motivazione, dell'attenzione e dell'elaborazione della ricompensa, la neurotrasmissione dopaminergica ha un ruolo chiave in diversi disturbi neuropsichiatrici, tra cui l'ASD.I ratti Fmr1 Δexon 8 sono stati convalidati come modello genetico di ASD basato sulla delezione di FMR1 e sono anche un modello di ratto di FXS.Qui, abbiamo eseguito esperimenti di neuroimaging SPECT comportamentali, biochimici e in vivo per studiare se i ratti Fmr1 Δexon 8 mostrano comportamenti ripetitivi simili all'ASD associati a cambiamenti nella disponibilità del trasportatore della dopamina striatale (DAT) valutata attraverso il neuroimaging SPECT in vivo.A livello comportamentale, i ratti Fmr1 Δexon 8 hanno mostrato iperattività nel test in campo aperto in assenza di comportamenti ripetitivi nel test del pannello forato.Tuttavia, queste alterazioni comportamentali non erano associate a cambiamenti nella disponibilità di DAT striatale come valutato mediante SPECT in vivo non invasiva e analisi Western blot.La 5a Edizione del Manuale Diagnostico e Statistico dei Disturbi Mentali1 definisce il disturbo dello spettro autistico (ASD) come un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da deficit persistenti nella comunicazione e interazione sociale e modelli di comportamento, interessi o attività ristretti e ripetitivi.La sindrome dell'X fragile (FXS) è una forma comune di disabilità intellettiva ereditaria (ID) e la principale causa monogenica di ASD2,3.È più comunemente causato da un'espansione ripetuta del trinucleotide di CGG nella regione del promotore del gene Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (FMR1), che porta alla metilazione, al silenziamento trascrizionale e all'assenza o alla carenza di FMRP.FMRP è una proteina legante l'RNA con un ruolo chiave nel controllo traduzionale di diversi mRNA, molti dei quali sono coinvolti nel mantenimento e nello sviluppo della funzione sinaptica e della plasticità4.Pertanto, in assenza di questa proteina, la deregolazione della traduzione, del trasporto e della stabilità dell'mRNA influisce su più percorsi neuronali, generando il caratteristico fenotipo dei pazienti affetti da FXS.Circa il 30% dei pazienti con FXS soddisfa i criteri diagnostici completi per ASD5 e oltre il 90% degli individui con FXS mostra alcuni sintomi ASD6, tra cui deficit cognitivi, disfunzioni sociali, labilità dell'umore, iperattività, elaborazione sensoriale alterata e convulsioni.La neurotrasmissione dopaminergica è un regolatore critico della funzione motoria, della ricompensa, della motivazione, dell'attenzione e dell'apprendimento7,8,9,10.Le disregolazioni del sistema dopaminergico cerebrale sono state implicate in una serie di disturbi neurologici e neuropsichiatrici, tra cui l'ASD11,12,13.È interessante notare che l'ipotesi della dopamina (DA) dell'ASD afferma che le disfunzioni nel sistema dopaminergico del mesencefalo potrebbero contribuire a comportamenti di tipo autistico14: quindi, i deficit sociali osservati nell'ASD potrebbero riflettere una disfunzione del circuito mesocorticolimbico, mentre i comportamenti ripetitivi/stereotipati potrebbero derivare da una disfunzione della via nigrostriatale15.Le proiezioni dopaminergiche originate dalla substantia nigra e dall'area tegmentale ventrale terminano nello striato, dove regolano la funzione motoria e l'attività complessiva e influenzano la segnalazione talamocorticale16.Il complesso striatale dei gangli della base comprende due distretti funzionalmente distinti, lo striato dorsale e ventrale, con il primo principalmente coinvolto nel controllo delle attività motorie insieme alla memorizzazione procedurale della memoria, e il secondo principalmente nella mediazione di motivazione, ricompensa ed emozione17.A causa del ruolo preminente dello striato nella funzione sensomotoria (p. es., controllo locomotore e formazione dell'abitudine), compiti associativi (p. es., comportamento diretto a un obiettivo) e comportamento motivazionale18,19,20 e la sua abbondanza nelle proiezioni DA21, è possibile che aberranti La segnalazione striatale DA potrebbe promuovere i modelli di comportamento stereotipati e perseveranti tipici dell'ASD22,23.Il trasportatore DA (DAT) svolge un ruolo fondamentale nel mantenere una segnalazione DA ottimale, poiché regola la disponibilità temporale e spaziale di DA24 eliminando rapidamente DA rilasciato dalla sinapsi.È interessante notare che le mutazioni del gene DAT sono state collegate all'ASD12 e l'espressione alterata del DAT nei roditori è stata correlata all'iperattività e ai comportamenti ripetitivi25,26, che sono i tratti distintivi dell'ASD27,28.Sebbene questi studi siano stati incrementali sul campo, la nostra comprensione dell'impatto della disregolazione del DAT nei deficit comportamentali tipicamente associati all'ASD e alle sue comorbidità è ancora limitata.I ratti Fmr1-Δexon 8 sono stati recentemente convalidati come modello animale genetico di ASD e modello di ratto di FXS29.È interessante notare che il modello di ratto Fmr1-Δexon 8, generato da nucleasi a dito di zinco (ZFN), risulta in un prodotto genico con una perdita dell'esone 8 che codifica un dominio all'interno del gene FMR1 che è responsabile del legame dell'RNA, il dominio KH1 .Sebbene questo modello animale differisca nel tipo di mutazione dagli esseri umani, questa delezione è sufficiente a causare tratti simili a FXS.In linea con questo, abbiamo recentemente dimostrato che i ratti Fmr1-Δexon 8 mostrano menomazioni cognitive, comunicative e sociali30,31, suggerendo la validità di questo modello animale nell'imitare i principali deficit comportamentali che caratterizzano FXS e alcune delle caratteristiche principali e comorbide di ASD non sindromico.Qui, abbiamo studiato se i ratti Fmr1-Δexon 8 mostrano una funzione motoria alterata eventualmente associata a cambiamenti nella disponibilità di DAT striatale.Durante l'ultimo decennio, gli scanner per la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la tomografia computerizzata a emissione di fotone singolo (SPECT) ad alta risoluzione sono stati sempre più impiegati per studiare il legame del trasportatore di neurotrasmettitori e del recettore in piccoli animali da laboratorio, fornendo nuove informazioni sul coinvolgimento della neurotrasmissione dopaminergica nei disturbi neurologici e psichiatrici32,33,34,35.Infatti, mentre altri strumenti sono stati utilizzati in campo preclinico per valutare la funzione DAT, alcune tecniche sono tecniche invasive o ex vivo che non consentono studi longitudinali.Al contrario, l'uso di una tecnica di neuroimaging come la SPECT permette la correlazione tra output comportamentali e l'attivazione/inattivazione di uno specifico target molecolare in una data regione del cervello.Dopo l'iniezione del radiofarmaco, la SPECT congela un'istantanea dell'attività cerebrale, che potrebbe essere quindi registrata e analizzata.Inoltre, mentre altre tecniche, come la cronoamperometria o la voltammetria, possono fornire migliori risoluzioni temporali e spaziali, la SPECT fornisce non solo la quantificazione ma anche la visualizzazione dei dati nel loro riferimento anatomico attraverso la sua semplice integrazione con altri sistemi di imaging morfologico.Inoltre, è una tecnica relativamente semplice che causa uno stress minimo all'animale essendo non invasiva e ha il potenziale per consentire studi longitudinali.Per consentire la ricerca traslazionale, nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi sistemi di imaging dedicati per piccoli animali da laboratorio, come topi e ratti.Tuttavia, l'estensione delle modalità di imaging dall'uomo ai piccoli animali deve affrontare alcune limitazioni principalmente legate alle differenze di dimensioni e intensità dei segnali biochimici tra le due specie.Per una migliore comprensione multidimensionale di fenomeni fisiopatologici complessi, la vera sfida attuale sarebbe quella di progettare sistemi sempre più sensibili con un'elevata risoluzione spaziale.In questo contesto, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un innovativo sistema SPECT per l'imaging e il neuroimaging di piccoli organi che implementa un metodo di risoluzione super spaziale (SSR) per superare le capacità di imaging ottenibili con i sistemi tradizionali36,37,38,39.Questo sistema offre l'opportunità unica di migliorare le prestazioni ottenibili con il potenziale per ottenere immagini cerebrali funzionali precliniche di qualità superiore39.Ciò si ottiene spostando il rilevatore con spostamenti sub-pixel.In questo modo l'informazione di conteggio dell'area dei pixel viene virtualmente suddivisa in aree più piccole, aumentando così la risoluzione delle immagini.Lo sfruttamento dell'algoritmo SSR per applicazioni scintigrafiche rappresenta una svolta che potrebbe migliorare le prestazioni degli scanner SPECT di nuova generazione.Approfittando di questa tecnica, abbiamo combinato analisi di neuroimaging SPECT comportamentali e in vivo come indagine preliminare sul ruolo del DAT striatale nel comportamento motorio disfunzionale dei ratti Fmr1-Δexon 8.L'esplorazione dei meccanismi neurobiologici coinvolti nel comportamento ripetitivo e nelle menomazioni motorie nell'ASD e nelle condizioni concomitanti tra cui la FXS migliorerà la nostra comprensione della patogenesi di questi disturbi neuropsichiatrici dello sviluppo, stimolando la ricerca su nuovi approcci terapeutici a queste condizioni.I ratti di controllo (wild-type) e Fmr1-Δexon 8 sono stati utilizzati per eseguire gli esperimenti descritti di seguito.Gli esperimenti comportamentali sono stati eseguiti su ratti giovani (35-40 giorni) e adulti (80-85 giorni) per valutare il comportamento locomotore e il potenziale comportamento stereotipato durante lo sviluppo.Esperimenti Western blot, test istologici e studi di imaging sono stati condotti su ratti adulti.Il disegno sperimentale è mostrato in Fig. 1.Ratti maschi e femmine di tipo selvaggio (WT) (Charles River Laboratories, Italia) e Fmr1-Δexon 8 (Horizon Discovery, precedentemente SAGE Labs, USA) su uno sfondo Sprague-Dawley sono stati accoppiati durante la notte.Le ratte gravide sono state alloggiate individualmente in gabbie Macrolon (40 (lunghezza) × 26 (larghezza) × 20 (altezza) cm), in condizioni controllate (temperatura 20–21 °C, 55–65% di umidità relativa e 12/12 ore di luce ciclo con luci accese alle 07:00).Le cucciolate trovate fino alle 17:00 sono state considerate nate in quel giorno (giorno postnatale (PND) 0).Al PND 1, le cucciolate sono state ridotte a otto animali (sei maschi e due femmine), per ridurre qualsiasi variabilità indotta dalle dimensioni della cucciolata nella crescita e nello sviluppo dei cuccioli durante il periodo postnatale.Il PND 21, i cuccioli sono stati svezzati e alloggiati in gruppi di tre (dello stesso sesso e stesso genotipo) e testati durante lo sviluppo.In ogni esperimento è stato utilizzato casualmente un cucciolo per figliata di diverse figliate per gruppo di trattamento.Gli esperimenti sono stati condotti sulla prole maschile.Gli esperimenti sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (Roma, Italia; Autorizzazione N° 849/2020-PR) ed eseguiti in accordo con le linee guida ARRIVE (Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments)40, le linee guida del Ministero italiano della Salute (DL 26/14) e la Direttiva Comunitaria 2010/63/UE.Il sistema di imaging ad alta risoluzione (HiRIS2) per studi preclinici è stato utilizzato per quantificare il legame del trasportatore della dopamina (DAT) nel cervello dei ratti Fmr1-Δexon 8 e WT utilizzando [123I]FP-CIT come radioligando.Lo scanner SPECT dedicato è costituito da due teste di rilevamento alloggiate in un gantry rotante.Il soggetto sperimentale è posto su un letto animale che può muoversi assialmente rispetto al piano di rotazione.La meccanica è progettata per consentire i movimenti necessari dei rivelatori per l'applicazione della tecnica Super Spatial Resolution (SSR) che potrebbe essere applicata per migliorare l'effettiva risoluzione spaziale ottenibile, rappresentando quindi un elemento chiave per lo studio di strutture cerebrali molto piccole38.A tale scopo vengono utilizzati carrelli di libertà multigrado per ottenere un fine allineamento sia lineare che planare dei rivelatori.Nello specifico, ogni testina HiRIS2 si basa su un PSPMT Hamamatsu H13700 accoppiato a uno scintillatore pixelato CRY018 ea un collimatore di tungsteno a bassa energia con fori quadrati paralleli.Infine, per ottenere un'immagine SPECT 3D, i due rivelatori sono stati montati in opposizione a 180° l'uno dall'altro.Gli animali sono stati abituati alla stanza sperimentale prima del test.Per ridurre al minimo le risposte allo stress e per consentire agli animali di familiarizzare con l'operatore, i ratti sono stati ampiamente manipolati per alcuni giorni consecutivi prima del test dallo stesso operatore che ha eseguito il test.In particolare, l'operatore progettato per il punteggio non era lo stesso operatore che ha manipolato gli animali ed eseguito il test e non era a conoscenza del genotipo degli animali;in altre parole, il punteggio è stato fatto in condizioni di buio.Il test è stato eseguito in una camera insonorizzata in condizioni di scarsa illuminazione, come precedentemente descritto41,42,43,44.L'apparecchio consisteva in un tavolo metallico quadrato grigio (40 × 40 × 10 cm; l × la × a) con 16 fori equidistanti (4 cm di diametro), inserito in un'arena di plexiglas (40 × 40 × 60 cm; l × l × a).Ogni ratto è stato posto individualmente nell'apparato per 5 min.Ogni sessione è stata registrata con una telecamera posizionata sopra l'apparato per la successiva analisi comportamentale eseguita utilizzando il software Observer 3.0 (Noldus Information Technology, NL).Il comportamento di immersione è stato valutato come il numero di volte in cui un animale ha inserito la testa in un buco almeno fino al livello degli occhi.Il test è stato eseguito come precedentemente descritto45.L'apparato era costituito da un'arena in plexiglas 45×45 cm, illuminata da lampade fluorescenti ad un'altezza di 2 m dal pavimento dell'apparato in campo aperto (intensità luminosa 30 lx).Il pavimento è stato pulito tra ogni prova per evitare indizi olfattivi.Ogni animale è stato trasferito in campo aperto di fronte ad un angolo ed è stato permesso di esplorare liberamente l'arena sperimentale per 15 min.L'attività locomotoria è stata valutata come segue43: sulle registrazioni è stata proiettata una griglia che divide l'arena in quadrati di uguali dimensioni e il numero di attraversamenti di linea effettuati dall'animale (ovvero la frequenza del passaggio dell'animale da una sezione della griglia a un altro) è stato registrato utilizzando il software Observer 3.0 (Noldus Information Technology, NL).In particolare, l'attraversamento è stato conteggiato nel momento in cui l'animale è passato da una sezione all'altra con tutte e quattro le zampe46.Durante il periodo di test di 15 minuti sono stati conteggiati anche i comportamenti spontanei di allevamento, in cui i roditori stanno sulle zampe posteriori con l'intenzione di esplorare.Abbiamo definito due forme di allevamento: allevamento non supportato (in cui l'animale si impenna senza entrare in contatto con le pareti dell'arena) e allevamento a parete (in cui l'animale si impenna contro le pareti dell'arena).Per valutare la tigmotassi (cioè, l'animale rimane vicino alle pareti del campo aperto), è stato misurato anche il tempo trascorso alla periferia e al centro del campo aperto e riportato come percentuale del tempo totale.L'apparato del labirinto sopraelevato comprendeva due bracci aperti (50 × 10 × 40 cm; l × l × a) e due chiusi (50 × 10 × 40 cm; l × l × a) che si estendevano da una piattaforma centrale comune (10 × 10 centimetri).Il test è stato eseguito come precedentemente descritto47,48.I ratti sono stati posizionati individualmente sulla piattaforma centrale del labirinto per 5 minuti.Ogni sessione di 5 minuti è stata registrata con una telecamera posizionata sopra l'apparato per la successiva analisi comportamentale effettuata da un osservatore, ignaro del trattamento degli animali, utilizzando il software Observer 3.0 (Noldus Information Technology, NL).Sono stati analizzati i seguenti parametri:% Tempo trascorso a braccia aperte (% TO): (secondi trascorsi a braccia aperte del labirinto/300 s) × 100;% entrate a braccia aperte (% OE): (il numero di entrate nelle braccia aperte del labirinto/numero di entrate nelle braccia aperte + chiuse) × 100;Numero di abbassamento della testa (movimento verso il basso della testa dei roditori verso il pavimento dalle braccia aperte);Numero di ingressi totali (frequenza di ingressi a braccia chiuse e aperte e al centro del labirinto).Le misurazioni SPECT dei siti di legame DAT sono state eseguite con il sistema HiRIS2 SPECT come precedentemente descritto39.Gli animali sono stati pretrattati mediante sonda gastrica con 10 μl di soluzione di Lugol, un agente bloccante della tiroide, 1 ora prima della somministrazione del radiofarmaco.Ciò ridurrà la dose di radiazioni alla tiroide e precluderà possibili effetti avversi sulla ghiandola, consentendo anche una migliore imaging cerebrale concentrando l'accumulo di iodio nell'area mirata49,50,51.Quindi, gli animali sono stati anestetizzati utilizzando isoflurano (IsoFlo, Zoetis, Regno Unito) a una concentrazione del 3% per l'induzione e del 2% per il mantenimento.Il legame DAT in vivo è stato misurato utilizzando il metil (3S,4S,5R)-8-(3-fluoropropil)-3-(4-iodofenil)-8-azabiciclo[3.2.1]ottano-4-carbossilato([123I]FP -CIT, DaTSCAN®) come radioligando, poiché è ampiamente utilizzato per valutare l'assorbimento striatale presinaptico nei gangli della base del cervello di ratto52,53,54,55.Una dose di 37 ± 4 MBq in 1,25 ml di DaTSCAN (GE Healthcare, DE) è stata somministrata nella vena caudale laterale.Le misurazioni di imaging sono state avviate 2 ore dopo la somministrazione del radioligando quando viene raggiunto l'equilibrio post-iniezione del legame [123I]FP-CIT, con il rapporto tra assorbimento striatale specifico e non specifico che rimane stabile nelle seguenti 4 ore56.In generale, negli studi di imaging su piccoli animali, l'iniezione endovenosa di [123I]FP-CIT (DaTSCAN) è stata utilizzata per visualizzare sia il DAT che i trasportatori della serotonina (SERT)54.Tuttavia, l'iniezione di DaTSCAN provoca un elevato accumulo di radioattività nello striato.In confronto, è stata osservata una captazione meno pronunciata nelle aree cerebrali con un'alta densità di siti di captazione serotoninergica, come il mesencefalo56.Pertanto, quando si valuta la funzione DAT striatale in vivo negli animali da laboratorio, di solito viene considerato solo il segnale striatale, sia per la limitata sensibilità e risoluzione della strumentazione disponibile sia per la possibilità di vedere elevati segnali extra-striatali nel mesencefalo anche a causa di il binding di DaTSCAN al SERT57,58.Sono state eseguite sia acquisizioni planari che SPECT.Le immagini planari sono state ottenute con acquisizioni di 30 minuti.Invece, ogni scansione SPECT è stata effettuata raccogliendo 48 proiezioni angolari su un arco di 360° (24 passi di 7,5°).Poiché è stato applicato il metodo SSR, sono state acquisite due immagini per posizione angolare.Successivamente, il tempo di scansione totale è stato di 48 min.Poiché il modulo CT non è implementato sul prototipo HiRIS2, potremmo eseguire una scansione TC sul cervello di ciascun ratto utilizzando un sistema preclinico U-CT (MILabs BV, NL).La ricostruzione SPECT è stata eseguita con l'algoritmo iterativo di aspettativa di sottoinsieme ordinato-massimizzazione (OSEM) utilizzando una conoscenza a priori dei dati CT fornendo una localizzazione precisa dell'assorbimento del radiotracciante.Per la coregistrazione dei dati funzionali SPECT con quelli tomografici, sono state acquisite misure di volume morfologico tridimensionale con uno scanner micro-CT con risoluzione isotropica di 0,08 mm.I cervelli dei ratti di entrambi i ratti Fmr1-Δexon 8 e del loro gruppo di controllo WT sono stati scansionati utilizzando uno scanner CT ottico 3D MILabs (MILabs BV, NL).Le impostazioni dello scanner CT erano identiche per tutte le scansioni.Ogni cervello di ratto è stato micro-TC tridimensionale (3D) acquisito con una risoluzione della dimensione del voxel di 80 μm utilizzando le seguenti impostazioni: 720 passi di 0,5 °;esposizione 40 ms;tensione 50kV;corrente, 0,43 mA, ottenendo un tempo di scansione totale di circa 2,5 min.L'output della ricostruzione era il tipo di file Neuroimaging Informatics Technology Initiative (NIftI), che è un formato comunemente utilizzato nell'informatica preclinica per l'imaging nucleare.Le ricostruzioni della scansione TC sono state eseguite utilizzando la retroproiezione filtrata (FBP) per la registrazione alle scansioni SPECT.Infine, le immagini coregistrate sono state elaborate utilizzando Mango—Multi-image Analysis GUI (Research Imaging Institute, UTHSCSA)59 e il software di immagini AMIDE (Amide's a Medical Image Data Examiner)60.Le viste assiali, coronali e sagittali e le sezioni SPECT co-registrate con il riferimento anatomico fornito dalla TC sono mostrate in Fig. 5.Al termine degli esperimenti, gli animali sono stati sacrificati e campioni di cervello sono stati rapidamente raccolti e fissati in formalina al 10%.Per l'ematossilina (Sigma-Aldrich, cat. MHS16) e l'eosina (Sigma-Aldrich, cat. 109.844) i campioni di analisi istologica sono stati inclusi in paraffina.Il sezionamento del microtomo è stato condotto per generare sezioni da 8 μm che sono state deparaffinate e reidratate.Per l'analisi istologica, è stata eseguita la colorazione standard con ematossilina ed eosina per valutare i cambiamenti significativi nell'organizzazione del tessuto grossolano dello striato dorsale tra i ratti Fmr1-Δexon 8 e WT e le immagini in campo chiaro sono state acquisite utilizzando un microscopio invertito dotato di 6 × e 40 × obiettivo (Leica Microdissector—LMD 7000, fotocamera Leica DFC310 FX).I test istologici e di immunocolorazione sono stati eseguiti sullo striato dorsale per supportare ulteriormente i risultati ottenuti dall'analisi SPECT.L'immunofluorescenza è stata condotta su sezioni da 8 μm deparaffinate e reidratate.Il recupero dell'antigene è stato condotto con tampone citrato pH-6, soluzione bollente per 10 min.La permeabilizzazione è stata effettuata con Triton X-100 allo 0,25% (Sigma-Aldrich, cat. 9002-93-1) in TBS 1X con siero di capra al 5% (Sigma-Aldrich, cat. G9023) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) .I campioni sono stati incubati durante la notte in una camera umidificata a 4 ° C con anticorpo primario anti-DAT (1:50, 22.524-1AP, Rabbit Polyclonal, Proteintech), in tampone bloccante (TBS 5% siero di capra).Il giorno dopo, i vetrini sono stati lavati con TBS 1X addizionato con Tween-20 allo 0,2% (Sigma-Aldrich, cat. P1379) e incubati con anticorpo secondario Alexa Fluor 568 adsorbito in modo incrociato (capra-anti-coniglio IgG A11011, Invitrogen) per 1 h a RT, quindi lavato nuovamente e colorato con DAPI (5 μM in PBS 1X per 5 min).I vetrini sono stati coperti con prolunga (P36930 ProLong™ Gold Antifade Mountant, Thermo Fisher) e chiusi con vetrini coprioggetto (Menzel-Glaser, Thermo Fisher).Le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un microscopio invertito dotato di obiettivo 40 × (Leica Microdissector—LMD 7000, fotocamera Leica DFC345 FX).L'immunoistochimica è stata condotta su sezioni deparaffinate e reidratate di 8 μm.Il recupero dell'antigene è stato condotto con una soluzione bollente di tampone citrato pH-6 per 10 minuti.Per bloccare l'attività della perossidasi endogena, abbiamo utilizzato un'incubazione per 30 minuti in una soluzione di perossido di idrogeno TBS-T 1% finale.La permeabilizzazione è stata effettuata con Triton X-100 allo 0,25% (Sigma-Aldrich, cat. 9002-93-1) in TBS 1X con siero di capra al 5% (Sigma-Aldrich, cat. G9023) per 1 ora a temperatura ambiente.I campioni sono stati incubati durante la notte in una camera umidificata a 4 ° C con anticorpo primario anti-DAT (1:50, 22.524-1AP, Rabbit Polyclonal, Proteintech), in tampone bloccante (TBS 5% siero di capra).Il giorno successivo, i vetrini sono stati lavati con TBS 1X (Bio-Rad, cat. 1.706.435) 0,2% TWEEN-20 (Sigma-Aldrich, cat. P1379) e incubati con anticorpo secondario anti-coniglio (Vectatain, Kit PK-4001).Infine, abbiamo utilizzato ABC Kit (Vectastain, PK-6100) come indicato, per amplificare il segnale.Il substrato utilizzato per rivelare la colorazione era DAB (Sigma-Aldrich, cat. D5905) e la reazione è stata bloccata con 1X PBS 5 mM EDTA.Dopo la disidratazione, i vetrini sono stati coperti con mezzo di montaggio Entellan (Merck, cat. 1.079.600.500).Le immagini in campo chiaro sono state acquisite utilizzando un microscopio invertito dotato di obiettivo 6 × (Leica Microdissector—LMD 7000, fotocamera Leica DFC310 FX).Tutti i test istologici e di immunocolorazione sono stati eseguiti sullo striato dorsale di ratti adulti Fmr1-Δexon 8 e WT.Per quanto riguarda le acquisizioni planari, per ogni ratto, le immagini SPECT e CT sono state coregistrate nell'ambito della risonanza magnetica cerebrale di ratto standard Paxinos46 fornita dal Neuroimaging Tools & Resources Collaboratory (NITRC Image Repository (NITRC-IR)—www.nitrc.org).A questo punto, l'elaborazione e l'analisi delle immagini sono state eseguite attraverso una valutazione semi-quantitativa della regione di interesse (ROI) sulle aree attivate dal cervello.In particolare, come mostrato in Fig. 3, i dati di imaging sono stati valutati definendo un'area comprendente ciascuno striato e un'altra corrispondente alla regione del cervelletto.Pertanto, sono stati determinati i tassi massimi di conteggio striatale (conteggi/pixel), nonché i tassi di conteggio di riferimento cerebellari (conteggi/pixel).È stata calcolata la media dei tassi di conteggio striatale sinistro e destro.Le misure semi-quantitative per la quantificazione del potenziale di legame sono state valutate come rapporti tra l'assorbimento specifico striatale e l'assorbimento non specifico del cervelletto61.In particolare, il rapporto di legame specifico striatale (SBRSTR) è stato calcolato come:dove CSTR e CCB sono, rispettivamente, il conteggio medio nella ROI dello striatale e del cervelletto.Invece delle ricostruzioni volumetriche, la TC tridimensionale e tutti gli studi SPECT ricostruiti sono stati trasferiti a una workstation con doppio processore Xeon (Intel Corporation, USA) per l'analisi delle immagini e il rendering 3D (Fig. 5).Per integrare i risultati SPECT e immunoistologici, abbiamo eseguito esperimenti Western blot per valutare i livelli di proteina DAT nello striato dorsale e ventrale dei ratti Fmr1-Δexon 8 rispetto agli animali di controllo WT.I campioni di tessuto sono stati raccolti e conservati a -80°C.Lo striato dorsale e ventrale è stato sonicato in tampone RIPA ghiacciato integrato con inibitori della proteasi (Roche, cat. 05.892.791.001) e della fosfatasi (Roche, cat. 4.906.845.001), centrifugato a 13.000 rpm per 15 minuti e sono stati raccolti i surnatanti.Il contenuto proteico è stato quantificato utilizzando il colorimetrico Breadford assay e 15 μg di proteine ​​per ciascun campione sono stati caricati e risolti mediante elettroforesi SDS-PAGE a 120 V. Successivamente, le proteine ​​sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante sistema Turbo-blot (2,5 V, 25 mA, 3 min) ed è stata eseguita una colorazione Ponceau per verificare la qualità del trasferimento.La membrana è stata quindi bloccata nel buffer di blocco everyblot (Bio-Rad, cat. 12.010.020) per 5 minuti e incubata con l'anticorpo primario anti-DAT di coniglio (1:2000, Proteintech, cat. 22.524–1-AP) in TBS con il 3% BSA + 0,1% Tween-20 durante la notte a + 4 °C.Dopo i lavaggi, le membrane sono state incubate con anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi di rafano (1:15.000, betile, cat. 1.704.150) per 1 ora a temperatura ambiente.Le bande sono state visualizzate da Clarity ECL (Bio-Rad, cat. 1.705.060) e l'analisi densitometrica eseguita da ImageLab Software (versione 6.1, Bio-Rad).I valori densitometrici sono stati normalizzati alla colorazione di Ponceau e l'espressione relativa di DAT nei ratti Fmr1-Δexon 8 è stata riportata come cambiamento di piega sui controlli WT.I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM).Per valutare gli effetti del genotipo sui parametri comportamentali, i dati sono stati analizzati con il t-test di Student.La dimensione del campione (n) è indicata nelle legende delle figure e si basava sui nostri precedenti esperimenti e sull'analisi della potenza eseguita con il software G*Power.I potenziali valori anomali all'interno di ciascun set di dati sono stati calcolati utilizzando il software GraphPad Prism 8 (metodo di Grubbs).Un osservatore esperto che non era a conoscenza dei trattamenti ha valutato tutti i test comportamentali valutati utilizzando il software Observer 3.0 (Noldus Information Technology, NL).I valori SBRSTR misurati dei due gruppi sono stati analizzati con i test t di Student ed espressi come media ± L'analisi dei dati SEM è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 8.Le differenze statistiche tra i due gruppi sono state analizzate con i test t di Student ei relativi valori espressi come media ± SEM L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 8.Questo studio è stato eseguito e riportato in conformità con le linee guida ARRIVE40, 62. Sono state seguite tutte le linee guida istituzionali e nazionali applicabili per la cura e l'uso degli animali.Il protocollo è stato approvato dal Ministero della Salute italiano (Roma, Italia; Autorizzazione N° 849/2020-PR).Sia i ratti Fmr1-Δexon 8 giovani che quelli adulti non hanno mostrato comportamenti ripetitivi nel test della tavola forata poiché il numero di immersioni della testa non differiva tra ratti WT e Fmr1-Δexon 8 (PND 35-40: t = 0,34, p = ns, df = 34; PND 80-85: t = 0,38, p = ns, df = 31; Fig. 2A e G).Inoltre, ratti Fmr1-Δexon 8 sia giovani che adulti non hanno mostrato comportamenti ripetitivi nel test in campo aperto come numero di allevamenti (PND 35-40: t = 0,52, p = ns, df = 14; PND 80-85: t = 0.94, p = ns, df = 18; Fig. 2 (B e H) e rialzi a parete (PND 35–40: t = 1.92, p = ns, df = 14; PND 80–85: t = 0.14, p = ns, df = 18; Fig. 2C e I) era simile al gruppo WT.Studi comportamentali: comportamento stereotipato e attività locomotoria nei ratti Fmr1-Δexon 8.Sia i ratti giovanili (A) che quelli adulti (G) Fmr1-Δexon 8 non hanno mostrato comportamenti ripetitivi nel test del pannello forato poiché il numero di immersioni della testa non differiva tra i ratti wild-type (WT) e Fmr1-Δexon 8 (PND 35 -40: WT = 11; Fmr1-Δesone 8 = 14; PND 80-85: WT = 18; Fmr1-Δesone 8 = 15).Inoltre, i ratti Fmr1-Δexon 8 giovani e adulti non hanno mostrato comportamenti ripetitivi nel test in campo aperto poiché il loro numero di allevamenti (B e H) e allevamenti a parete (C e I) era simile agli animali WT.Al contrario, i ratti Fmr1-Δexon 8 hanno mostrato iperattività nel test in campo aperto come espresso nell'aumento del numero di incroci rispetto ai controlli WT (D e J).Inoltre, i ratti giovani Fmr1-Δexon 8 hanno trascorso meno tempo alla periferia del campo aperto (E) e più tempo al centro dell'arena (F) rispetto ai ratti WT.Queste differenze non sono state osservate in età adulta (K e L, rispettivamente) (PND 35-40: WT = 8; Fmr1-Δeson 8 = 8; PND 80-85: WT = 10; Fmr1-Δexon 8 = 10).I dati rappresentano mezzi ± SEM.*p <0,05, **p <0,01 rispetto al gruppo WT (test t di Student).Al contrario, i ratti Fmr1-Δexon 8 hanno mostrato iperattività nel test in campo aperto in quanto hanno presentato un numero maggiore di incroci rispetto ai loro controlli WT (PND 35-40: t = 2,92, p <0,05, df = 14; PND 80-85 : t = 2.69, p < 0.05, df = 18; Fig. 2D e J).Inoltre, solo i giovani ratti Fmr1-Δexon 8 hanno trascorso meno tempo nella periferia del campo aperto rispetto ai ratti WT (PND 35-40: t = 3,47, p <0,01, df = 14; PND 80-85 t = 1,40, p = ns, df = 18; Fig. 2E e K), e tempo più lungo nella parte centrale dell'arena (PND 35–40: t = 3.56, p <0.01, df = 14; PND 80–85: t = 1.40, p = ns, df = 18; Fig. 2F e L), suggerendo una tigmotassi ridotta nei ratti Fmr1-Δexon 8 giovani ma non adulti.Per valutare se l'iperattività mostrata dai ratti Fmr1-Δexon 8 potesse essere correlata a un fenotipo ansioso, abbiamo anche eseguito il test del labirinto più elevato durante lo sviluppo.Di conseguenza, i ratti Fmr1-Δexon 8 sia giovani che adulti non hanno mostrato comportamenti simili all'ansia (Figura 1 supplementare): ad esempio, non sono state riscontrate differenze nella percentuale di tempo trascorso a braccia aperte (PND 35-40: t = 0.03, p = ns, df = 33; PND 80–85: t = 0.24, p = ns, df = 34; Supplementary Fig. 1 (A and E)), in the percentage of open arm entries (PND 35 –40: t = 0.43, p = ns, df = 33; PND 80–85: t = 0.20, p = ns, df = 34; Supplementary Fig. 1 (B and F)), and in the frequency of head- dippings (PND 35–40: t = 0.77, p = ns, df = 33; PND 80–85: t = 0.20, p = ns, df = 34; Supplementary Fig. 1 (C and G)).Nat.Corr.Corr.Corr.Sci.Nat.Davanti.Sci.Sci.Davanti.Davanti.Davanti.Med.Sci.Davanti.Mol.Med.Sci.Davanti.Mol.Davanti.Med.Med.Med.Davanti.Mol.Davanti.Sci.Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.Chiunque con cui condividi il seguente link sarà in grado di leggere questo contenuto:Fornito dall'iniziativa di condivisione dei contenuti Springer Nature SharedIt